有效防止样品蒸发及孔间污染；
适用于SBS标准的塑料板；
可密封管架结构的板子及8联排管

　　ELISA试剂盒测定原理及常见问题有哪些?

　　ELISA试剂盒测定原理

　　ELISA试剂盒的测定原理基于抗原-抗体特异性结合和酶催化显色反应，通过颜色变化实现目标物的定性与定量分析。其核心步骤包括：将抗原或抗体固定于固相载体表面，加入待测样本后形成免疫复合物，经洗涤后加入酶标记的检测抗体或抗原，最后通过底物显色反应测量吸光度值。

　　一、基本原理

　　‌抗原-抗体特异性结合‌：目标分子与对应抗体通过生物分子间的互补结构形成稳定复合物，具有高特异性和灵敏度。

　　‌酶标记与信号放大‌：酶(如辣根过氧化物酶)与抗体或抗原偶联，加入底物后产生颜色信号，显色强度与目标物浓度成正比。

　　‌定量分析‌：通过酶标仪测量吸光度(OD值)，结合标准曲线计算目标物浓度。

　　二、常用检测模式

　　‌直接法‌：抗原包被于固相载体，直接加入酶标记的一抗检测。操作简便，但需为每种抗原制备特异性酶标一抗，通用性低。

　　‌间接法‌：一抗与抗原结合，再加入酶标记的二抗检测。灵敏度高，常用于抗体检测。

　　‌夹心法‌：两个抗体夹抗原形成三明治结构，适用于大分子抗原检测。

　　‌竞争法‌：标本中的抗原与酶标抗原竞争结合固相抗体，适用于小分子抗原及半抗原检测。

　　ELISA试剂盒常见问题

　　一、标曲拟合不佳

　　原因‌：标准品溶解、倍比稀释时未涡旋震荡或不够充分;温度过低或试剂盒回温不充分;板条未密封好，产品受潮;移液器未经过校准/加样量不均一;洗板操作不当，板孔少洗或漏洗;显色剂变质(B液出现浅蓝色);洗涤液变质长菌;加入标准品后，没有混匀。

　　解决方案‌：标准品溶解、倍比稀释时均需要涡旋震荡以保证充分混匀;严格按照说明书规定操作;使用有效期内的试剂盒，防止组分被污染;试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的板条及其他组分要密封保存于4℃冰箱;试剂、样品和酶标板条等使用前需平衡至室温。

　　二、显色浅，灵敏度低

　　原因‌：试剂盒运输时间过长，环境高温影响，酶的活性降低;试剂盒(包括未用完的板条及其他组分)保藏条件不正确;试剂盒已超出有效期;试剂、样品和酶标板条等使用前未平衡至室温;标本用NaN3防腐，影响了酶活性;试剂开启时间过长，被污染;不同批号试剂混用;孵育温度低于37℃;孵育时间不够;加样量不足;移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内残留液体过多;显色剂加量不足，或加入顺序错误。

　　解决方案‌：尽量缩短试剂运输时间，运输时加冰袋保持低温;试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的板条及其他组分要密封保存于4℃冰箱;重新购置在有效期内的试剂盒;试剂、样品和酶标板条等从低温保藏条件中拿出来后，要先平衡至室温才可以后续操作;标本使用其他不影响酶活性的防腐剂;试剂开启后应在尽可能短的时间内用完，避免使用被污染的试剂;使用同一批号试剂;注意恒温箱中水位是否合适，在保证不没过酶标板的前提下，尽量抬高水位，以保证反应温度;注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37±0.5℃;经常校正移液器;按照说明书要求，先加入A液，再加入B液，并保证加样量。

　　三、假阳性多，本底高甚至花板

　　原因‌：封闭不充分、抗体浓度过高或显色时间过长;样本存在有机溶剂污染;0ppb标准品被污染;显色液B液被污染;整个操作时间过长、造成反应时间不同(第一孔与最后一孔反应时间相差很悬殊)，气温高时更明显;孵育温度过高(夏季、恒温箱错误)或时间过久;洗涤液配制时稀释度过高、洗板次数不够、手工洗板方式不正确;显色完后没有在规定时间内终止反应。

　　解决方案‌：优化封闭液和严格控制反应时间;避免样本被污染，注意试剂的储存温度和保存时间;严格按照说明书规定操作;注意洗板操作，避免板孔少洗或漏洗;显色完后需在规定时间内终止反应。

　　四、标准曲线不佳/重复性不好

　　原因‌：移液器未经过校准/加样量不均一;洗板操作不当，板孔少洗或漏洗;显色剂变质(B液出现浅蓝色);洗涤液变质长菌;加入标准品后，没有混匀;移液器的使用维护不规范，造成移液的误差较大;实验者自身的操作习惯、加样的一致性对复孔的CV也有很大影响。

　　解决方案‌：经常校正移液器;注意洗板操作，避免板孔少洗或漏洗;显色剂需避光保存，避免长时间暴露;洗涤液需定期检查，避免变质长菌;加入标准品后需充分混匀;掌握移液器的正确使用和维护;同一样本做2-3个复孔取平均值。

　　五、白板

　　原因‌：忘记加样(标本、标准品等);忘记加酶;忘记加显色液;试剂盒、酶或A、B液被污染或/和失效;把终止液当A液加入。

　　解决方案‌：严格按照说明书规定操作;试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的板条及其他组分要密封保存于4℃冰箱;使用有效期内的试剂盒，防止组分被污染;注意相应试剂加样顺序。

　　六、显色淡

　　原因‌：试剂盒运输时间过长，环境高温影响，酶的活性降低;试剂盒(包括未用完的板条及其他组分)保藏条件不正确;试剂盒已超出有效期;试剂、样品和酶标板条等使用前未平衡至室温;标本用NaN3防腐，影响了酶活性;试剂开启时间过长，被污染;不同批号试剂混用;孵育温度低于37℃;孵育时间不够;加样量不足;移液时抽吸排放过快，有气泡、或吸头内残留液体过多;显色剂加量不足，或加入顺序错误。

　　解决方案‌：尽量缩短试剂运输时间，运输时加冰袋保持低温;试剂盒内所有组分都应当在4℃冷藏，未使用完的板条及其他组分要密封保存于4℃冰箱;重新购置在有效期内的试剂盒;试剂、样品和酶标板条等从低温保藏条件中拿出来后，要先平衡至室温才可以后续操作;标本使用其他不影响酶活性的防腐剂;试剂开启后应在尽可能短的时间内用完，避免使用被污染的试剂;使用同一批号试剂;注意恒温箱中水位是否合适，在保证不没过酶标板的前提下，尽量抬高水位，以保证反应温度;注意控制恒温箱温度，尽可能让其稳定在37±0.5℃;经常校正移液器;按照说明书要求，先加入A液，再加入B液，并保证加样量。

　　七、高背景/非特异性染色

　　原因‌：封闭不充分、抗体浓度过高或显色时间过长;样本存在有机溶剂污染;0ppb标准品被污染;显色液B液被污染;整个操作时间过长、造成反应时间不同(第一孔与最后一孔反应时间相差很悬殊)，气温高时更明显;孵育温度过高(夏季、恒温箱错误)或时间过久;洗涤液配制时稀释度过高、洗板次数不够、手工洗板方式不正确;显色完后没有在规定时间内终止反应。

　　解决方案‌：优化封闭液(如5%脱脂奶粉)和严格控制反应时间;避免样本被污染，注意试剂的储存温度和保存时间;严格按照说明书规定操作;注意洗板操作，避免板孔少洗或漏洗;显色完后需在规定时间内终止反应。

　　注：以上仅供参考，不作为实验依据，具体请联系品牌或技术老师!

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